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膜蛋白難表達(dá)、難折疊、難檢測？
珀羅汀無細(xì)胞表達(dá)攜手Gator® BLI檢測帶來全新解決方案！
近日，珀羅汀生物(PLD technology）利用自主無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，成功合成全長人源STEAP1膜蛋白，通過Gator® BLI技術(shù)高效完成與對應(yīng)抗體的親和力檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，去垢劑(Detergent) 與納米盤(Nanodisc)兩種形式的STEAP1膜蛋白均表現(xiàn)出優(yōu)異的抗原活性，納米盤膜蛋白的BLI親和力檢測下限甚至達(dá)到0.078 nM!
本次實(shí)驗(yàn)所用STEAP1膜蛋白為珀羅汀生物全長跨膜蛋白產(chǎn)品：Human STEAP1 Full-Length Protein（Detergent），PLDP0057-1；Human STEAP1 Full-Length Protein（Nanodisc），PLDP0057-2。所用抗體為商業(yè)化小鼠單克隆STEAP1抗體，購自圣克魯斯生物（Santa Cruz Biotechnology），名稱與目錄號：STEAP抗體(B-4)，sc-271872；純度95%。BLI親和力檢測由小鱷生物 Gator Bio 檢測并提供實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
去垢劑形式的STEAP1膜蛋白示意圖（左）與SDS-PAGE圖（右）
納米盤形式的STEAP1膜蛋白示意圖（左）與SDS-PAGE圖（右）
1. 去垢劑形式STEAP1膜蛋白：背景干凈、結(jié)合穩(wěn)定
首先儀器探針利用Strep標(biāo)簽固化去垢劑體系中的STEAP1膜蛋白（10 μg/mL），隨后結(jié)合STEAP1抗體（50 nM）；另外設(shè)置三組陰性對照。結(jié)果表明，去垢劑形式的STEAP1膜蛋白與探針結(jié)合牢固，且與抗體特異性結(jié)合顯著。空白對照組結(jié)果顯示，在去垢劑體系中，抗體與探針無非特異結(jié)合，背景干凈。
2. 納米盤體系STEAP1膜蛋白：親和力強(qiáng)
同樣先用探針固化納米盤體系中的STEAP1膜蛋白（10 μg/mL），隨后結(jié)合STEAP1抗體（50 nM）；實(shí)驗(yàn)緩沖液中添加0.05% Tween 20。結(jié)果顯示，納米盤體系中的STEAP1膜蛋白與探針結(jié)合良好，且與抗體的特異性結(jié)合信號清晰。空白對照組結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)緩沖液添加0.05% Tween 20的實(shí)驗(yàn)條件下，抗體與探針無非特異結(jié)合。
3. 超高親和力，數(shù)據(jù)超越預(yù)期
通過控制兩種形式的STEAP1膜蛋白在探針上的固化量一致（固化高度均為1.6 nm），分別結(jié)合不同濃度抗體（100 nM，2倍梯度稀釋），分別測定去垢劑和納米盤體系中，STEAP1膜蛋白與抗體的親和力。其中，納米盤體系在是鹽緩沖液中添加0.05% Tween 20；另外，在相同條件檢測納米盤組分中的“膜支架蛋白"與抗體的非特異結(jié)合情況。
結(jié)果顯示，去垢劑形式的STEAP1膜蛋白與其抗體的親和力約 0.619 nM；而納米盤形式的STEAP1膜蛋白與其抗體的親和力達(dá)到驚人的0.0782 nM，且膜支架蛋白與抗體無非特異結(jié)合！
去垢劑形式STEAP1膜蛋白與不同濃度梯度抗體親和結(jié)果
納米盤形式STEAP1膜蛋白與不同濃度梯度抗體親和結(jié)果
膜支架蛋白與STEAP1抗體無非特異結(jié)合
這一結(jié)果有力證明：
（1）珀羅汀納米盤形式的膜蛋白具有極其優(yōu)異的親和活性，其親和力甚至比去垢劑模式的膜蛋白先近一個數(shù)量級！
（2）珀羅汀無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)兼容去垢劑與納米盤表達(dá)，突破膜蛋白表達(dá)與檢測局限！
無細(xì)胞表達(dá)+BLI檢測：膜蛋白研究黃金組合
無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)是攻克膜蛋白表達(dá)難題的“法寶"。通過在反應(yīng)體系中直接添加去垢劑或納米盤，可以為膜蛋白跨膜區(qū)提供疏水環(huán)境，實(shí)現(xiàn)膜蛋白正確折疊與可溶性表達(dá)。無細(xì)胞表達(dá)技術(shù)克服了膜蛋白疏水性高、易錯誤折疊、易沉淀的諸多難點(diǎn)，無需繁瑣的提取過程，即可獲得高可溶性的膜蛋白。
BLI，即生物膜層干涉技術(shù)，是一種實(shí)時監(jiān)測生物分子間相互作用的光學(xué)分析技術(shù)。它可以無標(biāo)記、實(shí)時檢測兩種生物分子的親和力，具備操作簡單、可實(shí)時監(jiān)測、高通量、耐受去垢劑的優(yōu)勢，非常適合膜蛋白抗原活性檢測。
“無細(xì)胞表達(dá)+BLI檢測"是膜蛋白研究的高效、可靠方案，其技術(shù)優(yōu)勢包括：
（1）活性優(yōu)異：無細(xì)胞技術(shù)制備的膜蛋白可直接用于互作研究，且具有高抗原活性；
（2）檢測快速：BLI技術(shù)無需標(biāo)記、實(shí)時監(jiān)測，顯著提升膜蛋白活性檢測效率；
（3）兼容性強(qiáng)、契合度高：無細(xì)胞表達(dá)技術(shù)可靈活選擇去垢劑、納米盤體系表達(dá)膜蛋白，兩種體系中的膜蛋白均可兼容BLI檢測，且背景干凈。
無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)不僅克服了傳統(tǒng)膜蛋白表達(dá)的限制，更與BLI等現(xiàn)代檢測技術(shù)高度協(xié)同，為抗體藥物開發(fā)、膜蛋白功能研究等領(lǐng)域提供了高效、靈活、可靠的一站式解決方案。未來，我們將繼續(xù)推動無細(xì)胞技術(shù)在復(fù)雜蛋白表達(dá)中的應(yīng)用，助力更多前沿研究與轉(zhuǎn)化突破！
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