天然氨基酸數(shù)量有限、結(jié)構(gòu)保守，其構(gòu)成的天然蛋白質(zhì)已經(jīng)無法滿足蛋白質(zhì)工程以及蛋白藥物開發(fā)等領(lǐng)域的研究需求。

非天然氨基酸（non-natural amino acids, nnAAs）有結(jié)構(gòu)多樣的側(cè)鏈基團(tuán)，將其插入到蛋白質(zhì)中可賦予蛋白質(zhì)新的化學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及功能。非天然氨基酸插入為生物研究、生物治療學(xué)及合成生物學(xué)提供了新的途徑，在新興領(lǐng)域中應(yīng)用前景廣闊：

（1）非天然蛋白質(zhì)藥物開發(fā)：nnAAs特殊的化學(xué)功能基團(tuán)極大地拓展了蛋白質(zhì)藥物的設(shè)計(jì)空間，同時(shí)也為位點(diǎn)特異性偶聯(lián)開辟了新途徑，使抗體偶聯(lián)藥物具有良好的藥代動(dòng)力學(xué)、效價(jià)和抗原結(jié)合特性。

（2）酶進(jìn)化：傳統(tǒng)的酶或蛋白質(zhì)工程依賴于用其余的19種天然氨基酸中的一種取代某一位點(diǎn)的某種氨基酸來改變酶或蛋白質(zhì)的功能特性，而nnAAs的插入可以產(chǎn)生具有更高穩(wěn)定性和改變催化性質(zhì)的酶。

（3）非天然氨基酸探針：nnAAs作為高靈敏度的生物物理探針，可結(jié)合到重組蛋白質(zhì)的特定位點(diǎn)，用于目標(biāo)蛋白質(zhì)的定量檢測(cè)及結(jié)構(gòu)和功能的精確分析。

（4）蛋白質(zhì)材料：nnAAs插入可以產(chǎn)生新型蛋白質(zhì)聚合物，以用于合成生物材料，例如合成生物粘合劑等。

與細(xì)胞蛋白表達(dá)相比，無細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)在非天然氨基酸插入領(lǐng)域具有天然優(yōu)勢(shì)：

（1）無細(xì)胞系統(tǒng)沒有細(xì)胞膜阻礙，規(guī)避了nnAAs選擇性問題；

（2）無細(xì)胞系統(tǒng)不受nnAAs可能產(chǎn)生的細(xì)胞毒性作用影響；

（3）有利于精細(xì)調(diào)控反應(yīng)進(jìn)程。

無細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)作為可靈活嵌入非天然氨基酸的強(qiáng)大技術(shù)臺(tái)，避免了nnAAs的跨膜及胞內(nèi)運(yùn)輸障礙、細(xì)胞生長毒性的問題，在研究蛋白質(zhì)間相互作用、開發(fā)蛋白質(zhì)藥物、新型蛋白材料方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

珀羅汀生物對(duì)綠色熒光蛋白（GFP）進(jìn)行非天然氨基酸定點(diǎn)插入，在CFPS體系中成功表達(dá)了含非天然氨基酸（pAcF/pAzF）的GFP，其中pAcF插入效率超過70%。pAzF插入效率低于pAcF，這可能是由于pAzF的疊氮基在生理?xiàng)l件下不穩(wěn)定，導(dǎo)致pAzF被還原為對(duì)氨基苯丙氨酸（pAF）。